====== abs.qpcr() ====== \\ ---- \\ Título: //**Quantificação absoluta de genes (método da curva padrão) por Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR)**// A técnica da [[https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction|qPCR]] combina uma [[https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction|PCR]] normal com a detecção de [[https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore|fluoróforo]], permitindo que o resultado da reação seja obtido em tempo real. Essa técnica permite a [[https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore|quantificação absoluta]] de um gene a partir da construção de uma curva padrão, usando uma amostra com concentração conhecida do gene. A saída do equipamento de qPCR refere-se ao [[https://www.youtube.com/watch?v=H_xsuRQIM9M|Cycle Threshold]] (Ct), ou seja, o limite de detecção onde o sinal do gene que está sendo duplicado destaca-se da fluorescência emitida pelos componentes da reação. Este valor é utilizado para se determinar a quantidade do gene alvo na reação. A conversão deste valor para o numero de cópias do gene na reação é realizada a partir de uma curva padrão. A construção da curva padrão passa pela [[https://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_cloning|clonagem]] e extração do DNA de plasmídeos com quantidades conhecidas do gene alvo, as quais são diluídas de forma serial e incluídas na reação de qPCR. O cálculo do numero de cópias é feito a partir da regressão dos valores de Ct em função do logaritmo da concentraçâo do gene nas diferentes diluições dos padrões e a aplicação dos coeficientes linear e angular obtidos aos valores de Ct das amostras com concentração desconhecida do gene. Para a realização da conversão, seria necessária a entrada dos seguintes dados:\\ //Para a Curva Padrão//\\ - Concentração de DNA (em ng/µl) extraído dos plasmídeos clonados\\ - Diluições dessas concentrações utilizadas para a curva padrão\\ - Volume do extrato utilizado na reação de PCR\\ - Numero de pares de bases do plasmídeo clonado\\ - Numero de cópias do gene de interesse em cada plasmídeo clonado\\ - Valores de Ct das diluições utilizadas para a curva padrão\\ //Para a conversão//\\ - Valores de Ct das amostras\\ A saída da função seria, para cada amostra, a quantidade de cópias do gene alvo presente na reação de qPCR. Planejo incluir outras possibilidades de saídas, mediante o fornecimento de novas informações. Por exemplo, caso seja fornecida a informação da concentração de DNA das amostras, a saída será o numero de cópias do gene por nanograma de DNA. Caso a informação fornecida seja a quantidade de solo usado para extração de DNA, a saída será o numero de cópias por grama de solo. Olá Celio. Gostei da sua explicação da proposta. Gostaria de te fazer uma pergunta: O que te motivou a desenvolver essa proposta? Não há ferramentas prontas para realizar essa tarefa? Não há um pacote de R que já faça isso? A proposta me parece uma boa oportunidade de fazer um código legal. Vamos nos falando. ----//[[vitor.rca@gmail.com|Vitor Aguiar]]// \\ Olá, Vitor.\\ Minha motivação para esta proposta foi mais didática do que prática. Penso que a quantidade de detalhes dessa análise seja um bom laboratório para dominar as técnicas de fazer funções no R.\\ Existem vários programas pagos para a realização dessa tarefa e temos alguns pacotes baseados em R também (principalmente do projeto de desenvolvimento de software para bioinformática aberto [[http://www.bioconductor.org/|Bioconductor]] - que eu ainda nem comecei a tentar entender)... mas até o momento, no laboratório, fazemos os cálculos em planilhas do excel (então, no fim das contas, talvez ela seja bastante utilizada... hehehe).\\ A ideia é fazer uma função para a análise que fazemos no laboratório apenas, que é a quantificação absoluta por curva padrão. Mas creio que 80% dos trabalhos de qPCR são analisados dessa forma, então, uma função mais simples pode até vir a ser bastante útil...\\ =>[[biocelio@yahoo.com.br|Celio]]