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\section{\texorpdfstring{abs.qpcr()}{absqpcr}}
\label{sec:absqpcr}


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Título: \emph{\textbf{Quantificação absoluta de genes (método da curva padrão) por Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR)}}

A técnica da \href{https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction}{qPCR} combina uma \href{https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction}{PCR} normal com a detecção de \href{https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore}{fluoróforo}, permitindo que o resultado da reação seja obtido em tempo real. Essa técnica permite a \href{https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore}{quantificação absoluta} de um gene a partir da construção de uma curva padrão, usando uma amostra com concentração conhecida do gene.

A saída do equipamento de qPCR refere-se ao \href{https://www.youtube.com/watch?v=H_xsuRQIM9M}{Cycle Threshold} (Ct), ou seja, o limite de detecção onde o sinal do gene que está sendo duplicado destaca-se da fluorescência emitida pelos componentes da reação. Este valor é utilizado para se determinar a quantidade do gene alvo na reação.

A conversão deste valor para o numero de cópias do gene na reação é realizada a partir de uma curva padrão. A construção da curva padrão passa pela \href{https://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_cloning}{clonagem} e extração do DNA de plasmídeos com quantidades conhecidas do gene alvo, as quais são diluídas de forma serial e incluídas na reação de qPCR.

O cálculo do numero de cópias é feito a partir da regressão dos valores de Ct em função do logaritmo da concentraçâo do gene nas diferentes diluições dos padrões e a aplicação dos coeficientes linear e angular obtidos aos valores de Ct das amostras com concentração desconhecida do gene.

Para a realização da conversão, seria necessária a entrada dos seguintes dados:\\
\emph{Para a Curva Padrão}\\
- Concentração de DNA (em ng/µl) extraído dos plasmídeos clonados\\
- Diluições dessas concentrações utilizadas para a curva padrão\\
- Volume do extrato utilizado na reação de PCR\\
- Numero de pares de bases do plasmídeo clonado\\
- Numero de cópias do gene de interesse em cada plasmídeo clonado\\
- Valores de Ct das diluições utilizadas para a curva padrão\\
\emph{Para a conversão}\\
- Valores de Ct das amostras\\

A saída da função seria, para cada amostra, a quantidade de cópias do gene alvo presente na reação de qPCR. Planejo incluir outras possibilidades de saídas, mediante o fornecimento de novas informações. Por exemplo, caso seja fornecida a informação da concentração de DNA das amostras, a saída será o numero de cópias do gene por nanograma de DNA. Caso a informação fornecida seja a quantidade de solo usado para extração de DNA, a saída será o numero de cópias por grama de solo.

Olá Celio.
Gostei da sua explicação da proposta. Gostaria de te fazer uma pergunta: O que te motivou a desenvolver essa proposta? Não há ferramentas prontas para realizar essa tarefa? Não há um pacote de R que já faça isso?
A proposta me parece uma boa oportunidade de fazer um código legal. Vamos nos falando.

----\emph{\href{mailto:vitor.rca@gmail.com}{Vitor Aguiar}}

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Olá, Vitor.\\
Minha motivação para esta proposta foi mais didática do que prática. Penso que a quantidade de detalhes dessa análise seja um bom laboratório para dominar as técnicas de fazer funções no R.\\
Existem vários programas pagos para a realização dessa tarefa e temos alguns pacotes baseados em R também (principalmente do projeto de desenvolvimento de software para bioinformática aberto \href{http://www.bioconductor.org/}{Bioconductor} - que eu ainda nem comecei a tentar entender)... mas até o momento, no laboratório, fazemos os cálculos em planilhas do excel (então, no fim das contas, talvez ela seja bastante utilizada... hehehe).\\
A ideia é fazer uma função para a análise que fazemos no laboratório apenas, que é a quantificação absoluta por curva padrão. Mas creio que 80\% dos trabalhos de qPCR são analisados dessa forma, então, uma função mais simples pode até vir a ser bastante útil...\\
$\Rightarrow$\href{mailto:biocelio@yahoo.com.br}{Celio}

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